血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳易出现的问题及对策

 郧阳医学院生化与免疫学实验室  孙社宗  

醋酸纤维薄膜（cellulose acetate membrane，CAM）电泳是一种简便、快速分离生物分子的实验技术，常用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白及同工酶的分离分析等，广泛的应用于临床检验和实验教学工作，其中应用最广泛的是血清蛋白CAM电泳。然而，由于影响血清蛋白CAM电泳的因素较多，要想得到理想的结果并非易事，在临床检验或实验教学过程中，因为实验准备、实验操作或教师指导方法不当等原因均可影响实验结果。探讨实验的各个环节，对提高临床检验水平和提高实验教学质量具有重要的意义，本文就实验过程中易出的问题和对策作了深入探讨。

1、影响血清蛋白CAM电泳的因素

1.1影响CAM电泳速度的因素

影响血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳速度的因素很多，包括CAM的性质，缓冲液的组成、pH、浓度和离子强度，缓冲液的流动[1]，电流和有效电压，电泳的时间和温度，电泳槽的密封性能等，任何一种因素发生改变都可影响血清蛋白电泳的速度。

1.2影响CAM电泳效果的因素

影响电泳效果的因素很多，主要因操作不当引起分离的电泳图谱不清或不整齐。最常见的原因有：①点样过多，被分离的物质不能分离成五条区带[2]；②点样不均匀、不整齐、被分离的区带出现斑点或锯齿状；③样品触及薄膜边沿，出现边流而分离不清楚；④薄膜过湿，样品扩散，导致样品分离不成区带；⑤薄膜未完全浸透或温度过高导致局部干燥或水分蒸发；⑥薄膜位置歪斜、弯曲，与电流方向不平行；⑦CAM桥垫的滤纸过少，缓冲液变质；⑧样品不新鲜，被污染或蛋白质变性，⑨CAM质量不好，⑩染色液过少，染色时CAM重叠等；上述任何一种因素都可影响CAM电泳的结果。

2、解决血清蛋白CAM电泳所出现问题的对策

2.1规范电泳前的准备

2.1.1将电泳槽置水平实验台上，两侧注入等量的pH8.6的缓冲液，液面与支架高度约在2.5cm左右，由于电泳槽的规格不同，应注意将支架的宽度调节在5.5～6cm，支架过宽电阻加大产生的热对电泳不利，膜条的长度也不够，支架过窄血清蛋白分离的距离过短，血清蛋白往往会渗入对侧滤纸桥中去，会影响实验结果。电泳槽两侧支架上应垫四层滤纸（或四层纱布）为桥垫，桥垫面不能呈钟形，应有1.5cm宽的平面，可增加醋酸纤维膜条与桥垫的接触面，有利于拉紧膜条。

2.1.2醋酸纤维薄膜条的准备

选择透水性好的醋酸纤维薄膜，在无光泽面的一端1.5cm处用硬铅笔轻画一条横线并编号，浸入pH8.6的缓冲液中，使之充分浸透，一般在20min左右，如使用时发现CAM上有白斑存在，应弃之不用。

2.1.3缓冲液的pH和离子强度

血清蛋白CAM电泳所用缓冲液为pH8.6的巴比妥缓冲液，配好后的缓冲液应用pH计校正，pH过低、过高都会影响电泳结果。缓冲液的离子强度应为0.06，如离子强度过低缓冲容量小，不易维持缓冲液的pH恒定，同时导致样品所载电流增加，电泳速度加快，带电颗粒在介质上扩散严重，分辨力明显降低。离子强度也受温度的影响，如温度过高或缓冲液使用时间过长，水分蒸发过多均可引起缓冲液的离子强度升高，则导致样品的带电量降低，使电泳速度减慢血清蛋白不易分离。

2.2电泳操作时应注意的几个问题

2.2.1样品

被分离的血清要新鲜且无溶血现象，如血清放置时间过长，血清蛋白质被细菌分解或变性，电泳时血清蛋白质可被分离出5条以上的区带，产生无意义结果。

2.2.2点样

点样是血清蛋白电泳的关键步骤[3]，也是最易出现问题的环节，血清点样过少，电泳时样品量太少不易观察结果不利于定量测定，点样过多在醋酸纤维薄膜上不易分离成五条区带，所以点样时必须注意以下几个方面的问题：①准备，用镊子从缓冲液中取出CAM置洁净的滤纸上吸去多余的水分，使CAM保持湿润状态又无明显的水分，如用滤纸吸水过度至CAM上出现白斑则不能使用，否则影响电泳结果；然后辨别光滑面和无光泽面，点样应点在无光泽面上，如点在光滑面上则血清不能渗入CAM内导致电泳失败。②点样，点样的方法有很多，首先将血清置载玻片上铺开，厚薄适中且无气泡，将CAM置一张洁净的滤纸上，然后用盖玻片或用X线胶片蘸适量血清（3～5µl）垂直印在CAM无光泽面一端的1.5cm～2cm处，由于CAM置滤纸上，血清渗入膜内后多余的血清可被滤纸所吸收，使点样均匀有利于血清蛋白在电泳中分离；点样时还应注意血清离膜条两侧要空1～2mm，如点样靠边易产生边流现象，影响实验结果。

2.2.3电泳

将点样后的膜条置电泳槽架的滤纸桥垫上，放置时应无光泽面（点样面）向下，点样端置于负极，点有血清的部位应离桥垫2mm，如血清压在桥垫上会影响分离结果；膜条与两侧桥垫要贴紧并拉直，中间不能下垂，如膜条中间下垂可导致血蛋白电泳时，蛋白质泳动至中间下垂区段时阻力加大，使蛋白质挤在一起不易分离。一个电泳槽支架上放置多条醋酸纤维薄膜条时，膜条之间要间隔几毫米。盖上电泳槽盖平衡5min通电。电压在8～15V/cm范围内均可电泳，通常电压为10V/cm左右，但与环境温度有关，室温较低时电泳速度较慢，电压可调高一点，反之则调低一些。进行醋酸纤维薄膜电泳时是要求稳压，但要关注电流，如电压调至10V/cm时电流为零时，说明电泳槽与电泳仪之间的线路有问题，或者是铂金丝电极没有浸入缓冲液中，应及时检查。

2.2.4染色与漂洗

血清蛋白CAM染色时所选择的染料应对蛋白质的各组分亲合力相同，吸光度与蛋白质的浓度成正比，并要求水溶性好、染料稳定、吸光度敏感，形成的染料蛋白质复合物稳定，且易洗脱比色。目前常用丽春红S，氨基黑10B作为染料染色，一般用光密度计扫描定量选择丽春红S染色，比色法定量用氨基黑10B染色，但染色时应注意染液多次染色后出现杂质，或染色液水分蒸发、多个CAM染色时膜条重叠都可影响染色结果。对血清蛋白过高的血清（如血清蛋白超过80g/L），由于标本中清蛋白过高，染色液对清蛋白染不透，可在清蛋白区带出现空泡，致使定量不准确，这样的标本应减少点样量或血清稀释后重新加样电泳。血清蛋白CAM染色5min后可取出置漂洗液中漂洗，期间需更换漂洗液三次（如室温过低，可将漂洗液加温至37 0C）每次5～10min，可得到血清蛋白分离出的清晰区带。然后用于扫描或比色定量。